In Situ Mikroskopie

Ein Prototyp eines In Situ Mikroskops wird vorgstellt, der zur inline-Partikelmessung in bewegten Medien beispielsweise in Zellkulturen während der Fermentation dient. Es handelt sich um ein Videomikroskop, das mit extrem kurzen Lichtblitzen Bilder bewegter Partikel ohne Bewegungsunschärfe erzeugt. Eine Probenextraktion ist nicht erforderlich, da das Instrument direkt in die gerührte Suspension des Bioreaktors gerichtet wird. Mit Hilfe automatischer Bild-verarbeitung werden die übertragenen Bilder in Echtzeit ausgewertet und Signale der mittleren Größe und der Konzentration erzeugt.

In Situ Microscopy

The prototype of an In Situ Microscope for inline-determination of size and concentration of particles in agitated suspensions is presented. It can be operated for inline-characterization of cell-populations during fermentations. The In Situ Microscope is a video-microscope with an extremely short flash illumination. The cells can thus be imaged insitu without extraction and preparation of samples – despite their rapid motion. Automatic image processing allows for online calculation of signals that monitor the size and the concentration of the microorganismus.

Einleitung

Bis heute ist eine effektive und kostengünstige inline – Charakterisierung dispergierter und bewegter Partikel eine Herausforderung für die Meßtechnik. In diesem Zusammenhang ist die Bestimmung der Zellen – Konzentration und der Zellenmorphologie in gerührten Bioreaktoren ein gutes Beispiel.

Eine inline – Patikelmeßtechnik muß ohne Probenextraktion (insitu) ein Signal in Echtzeit (online) des zu beobachtenden Prozesses liefern. Hierzu kann man beispielsweise die Streuung eines Lichtstrahls an den Partikeln nutzen. Das Streusignal wächst monoton mit der Partikelkonzentration. Dieses und andere Verfahren, die sich einer makroskopischen Meßgröße zur Signalisierung mikroskopischer Strukturen bedienen, sind zwar relativ einfach zu realisieren, jedoch schwer zu interpretieren. Ein makroskopisch definiertes Signal ist beispielsweise immer querempfindlich gegen Größenänderungen der Partikel, gegen Agglomeration, und gegen Fremdpartikel, namentlich Luftblasen.

Mit mehr apparativem Aufwand gelingt es auch, einzelne Partikel durch Lichtstreuung inline zu detektieren. Ein schnell kreisender Laserfokus erzeugt beim Überstreichen einzelner Partikel Streulichtpulse, deren statistische Häufgung – nach Dauer und Intensitätgeordnet – als Histogramme einen "Fingerabdruck" der Partikelverteilung abgeben. Die Interpretation dieser Signale ist allerdings nicht einfach, insbesondere falls morphologische Änderungen oder neue Partikelspezies auftreten. Auch die Eigengeschwindigkeit des Prozessmediums (Rührer!) kann die Histogramme beeinflussen.

Seit 1995 ist unter der Bezeichnung In Situ Mikroskopie auch eine Methode zur Mikrofotografie ohne Probenahme direkt in gerührten Medien bekannt [1], [2]. Ein In Situ Mikroskop (ISM) liefert eine videomikroskopische Direktübertragung aus der Suspension. Scharfe Bilder der Partikel – ohne Bewegungsunschärfe – werden erhalten, indem entweder das mikroskopierte Volumen mechanisch begrenzt und beruhigt wird [3], oder indem mit extrem kurzer Blitzbelichtung fotografiert wird [1]. Die Bilder der Partikel können unmittelbar visuell ausgewertet, aber auch mit online – Bildverarbeitung automatisch gezählt und klassifiziert werden. Bisherige In Situ Mikroskope, soweit sie ohne mechanische Begrenzung und Beruhigung des Mikroskopiervolumens konzipiert sind, basieren auf Blitzbelichtung mit Laserpulsen und sind apparativ noch recht aufwendig.

In diesem Artikel wird der Prototyp eines neuen In Situ Mikroskops vorgestellt, das durch einen vereinfachten Aufbau erstmals eine routinemäßige Anwendung bei verbesserter Leistung ermöglicht.

Apparitiver Aufbau

Ein Schema des In Situ Mikroskops ist in Abbildung 1 dargestellt.

Die Ummantelung des Instruments wird durch einen äußeren Tubus mit optischem Fenster und Belichtungskapsel an der Stirnseite gebildet. Sie paßt in Standardöffnungen von Fermentern und kann eingebaut unter Heißdampf mitsterilisiert werden. Beim Einsetzen des Videomikroskops wird also die Sterilbarriere nicht geöffnet. Eine Pulselektronik mit Luminiszenzdiode erzeugt ein Blitzlicht in der Suspension vor dem optischen Fenster mit einer Pulslänge von weniger als einer Mikrosekunde. Die im Blitzlicht aufgenommenen Mikroskopbilder werden ohne Lichtverstärkung von einer CCD –Kamera empfangen. Damit stehen sie der unmittelbaren Inspektion auf einem Monitor und einer Videodokumentation zur Verfügung. Außerdem können sie automatisch durch Bildverarbeitung ausgewertet werden. Die Übertragungsrate des jetzt entwickelten Prototyps liegt bei etwa zehn Bildern pro Sekunde.

ISM – Bilder und Virtuelles Probevolumen

Ein entscheidendes Merkmal der im ISM erzeugten Bildstrukturen ist ihre Prägung nicht allein durch die reale Gestalt der mikroskopierten Objekte, sondern auch durch deren unterschiedlich starke Abbildungs-Unschärfe – je nach zufälligem Abstand zum Objektiv. Eine unscharfe Zelle wirkt beispielsweise größer und verschwommener als eine scharfe. Auch ist ihr Kontrast tendenziell geringer. Im ISM entstehen demzufolge andere Bilder als bei einem scharf eingestellten Labormikroskop. Die Statistik von geometrischen und optischen Parametern der abgebildeten Zellen – wie etwa die statistische Verteilung ihrer äquivalenten Kreisdurchmesser oder ihrer Helligkeit – wird durch den Zufallsparameter "Unschärfe" modifiziert und dabei insbesondere verbreitert. Bei der quantitativen Auswertung der Bilder wird nun entweder explizit oder implizit eine willkürliche Obergrenze für die Ausprägung der Unschärfe in den registrierten Bildparametern festgelegt. Da die Unschärfe bei einem gegebenen Partikel eine monotone Funktion seines Abstands von der Position scharfer Bildfokussierung ist, wird für alle gleichartigen Objekte durch die festgelegte maximale Unschärfe automatisch ein fester Suspensionsbereich als Probevolumen abgegrenzt. Außerhalb dieses Probevolumens wird keine Zelle genügend scharf abgebildet, um in der Auswertung der Bilder noch berücksichtigt zu werden.

Diese nichtmechanische, "virtuelle" Festlegung des Probevolumens durch die Bildverarbeitung ermöglicht quantitative Messungen mit einem glatten Sensorkopf ohne spezielle Konstruktionen zur me chanischen Abgrenzung eines Probevo-lumens.

Signalverarbeitung der Bilddaten in Echtzeit

Die automatische Bildverarbeitung des ISM ermöglicht an Suspensionen von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae oder Hansenula anomala) die Auswertung von etwa einem Bild pro Sekunde, wenn ungefähr zwanzig Zellen im Bild detektiert werden. Hierbei werden kalibrierbare Signale der Größenverteilung und der Konzentration der Zellen errechnet.

Die Bildobjekte werden im Algorithmus der Bildverarbeitung ausgewertet, wenn ihre parametrisierte Abbildungsschärfe einen festgelegten Minimalwert überschreitet, sonst werden sie am Anfang der Bildverarbeitung bereits eliminiert. Die Zellenbilder werden nach Größe klassifiziert, indem entweder die Pixel der segmentierten Objekte gezählt werden, oder die Korrelation mit vordefinierten, verschieden großen Objektschablonen (Templates) berechnet wird. Man erhält auf diese Weise Histogramme, welche die Größenverteilung der Partikel charakterisieren und die Darstellung eines online – Signals der mittleren Partikelgröße gestatten. Aufgrund der Vorverarbeitung der Bilder mit Berücksichtigung der Abbildungsschärfe kommt der Gesamtzahl gefundener Objekte die Bedeutung eines Signals der Partikelkonzentration zu [1].

Die Online-Bildverarbeitung in der Praxis

Die mit Hilfe der online-Bildverarbeitung aus den Bildern extrahierten Signale können ohne weitere Maßnahmen bereits als Trendsignale oder als Vergleichssignale zur Beurteilung von Prozessverläufen herangezogen werden. Quantitative Bestimmungen definierter Partikelparameter erfordern allerdings eine Kalibrierung mit Standard – Suspensionen, worauf weiter unten eingegangen wird. Eine praxisgerechte und schnelle quantitative Bildverarbeitung setzt immer eine hinreichend eingegrenzte Variabilität der ausgewerteten Partikel voraus, weil grundverschiedene Partikelspezies jeweils eigene Parameter-Modelle zu ihrer Beschreibung erfordern. Sollten "Störobjekte" wie beispielsweise Luftbläschen auftauchen, so läßt sich ihr Signalbeitrag durch Erkennungs- Algorithmen eliminieren. Allerdings erfordert diese algorithmische Korrektur ausreichend starke optisch-geometrische Unterscheidungsmerkmale. Diese sind bei größeren Feststoffbrocken und Luftbläschen glücklicherweise meistens vorhanden.

Ein weiterer wichtiger praktischer Gesichtspunkt ist die Flexibilität der ISM-Bildverarbeitung, falls die Algorithmen anwendungsspezifisch variiert oder sogar grundlegend neu entwickelt werden müssen. Daher werden die Algorithmen des Prototyps in einer kommerziellen Entwicklungsumgebung mit visueller Programmierung angelegt (WiT - Visual Programming Software, Logical Vision bei Computer BV). Die Programme werden als Blockdiagramme aus Grundfunktionen der Bildverarbeitung zusammengesetzt und sind nach ihrer Erstellung sofort lauffähig für ISM-Anwendungen. Andere triggerbare Komplettsysteme der Bildverarbeitung können über einen Synchronisationspuls der Blitzelektronik an den optischen und elektronischen Teil des In Situ Mikroskops gekoppelt werden.

Anwendungsbeispiele

Abbildung 2 zeigt in einer Reihe von Fällen die Anwendung des In Situ Mikroskop.

Die Bilder a und b wurden in Suspensionen von Saccharomyces cerevisiae und Hansenula anomala bei einer Konzentration von etwa 10 8 ml –1 aufgenommen. Besonders im Vergleich dieser beidenBilder wird deutlich, daß in den ISM-Bildern morphologische Details deutlich hervortreten. So sind Unterschiede der mittleren Größe, der Form sowie der Häufigkeit der Zellteilung und Agglomeration gut erkennbar.

Suspensionen stark agglomerierter Zellen sind in den Bildern c und d repräsentiert. Auch hier sind die unterschiedlichen Volumina der Einzelzellen wahrnehmbar. Falls sich Gasbläschen im Medium entwickeln, tauchen sie je nach Orientierung des Meßkopfes mehr oder weniger häufig auch im Probevolumen des ISM auf. In Bild e ist zu sehen, wie Gasbläschen in einer Suspension von Hansenula anomala in einem Wasser/Glyzerin Gemisch mit den Zellen wechselwirken. Normalerweise ist selbst bei stark schäumenden Kulturbrühen das statistische Auftreten von Gasblasen in der Bildverarbeitung beherrschbar, da die Blasen sich durch einen relativ großen homogen schwarzen Randstreifen diskriminieren lassen. Übrigens zeigt der Vergleich von e mit b sehr deutlich, daß der osmotische Druck durch die Glyzerinmoleküle zu einer drastischen Schrumpfung der Zellen vom Typ Hansenula anomala führt.

Als letztes Beispiel wird in f eine gerührte Suspension von Gipskristallen in Wasser gezeigt. Es liegt hier nahe, in der Signalverarbeitung Histogramme der Projektionsflächen und der Quotienten aus Länge und Breite anzulegen, um diese Histogramme zur Carakterisierung des Kristallisationsprozesses zu verwenden.

Quantitative Messungen

Zwar ist oftmals bereits der direkte visuelle Eindruck der mikroskopischen Struktur einer bewegten Kulturbrühe nützlich und eindrucksvoll, doch darüber hinaus eröffnen die ISM-Bilder den Zugang zu halbquantitativen Trendsignalen und letztlich zu quantitativen online-Messungen und zur Prozessregelung.

In Abbildung 3 sind die Ergebnisse eines Demonstrationsexperiments mit automatischer Bildverarbeitung in Echtzeit dargestellt. In einer gerührten Suspension von Saccharomyces cerevisiae in Wasser wurde im Verlauf von etwa zwei Stunden zunächst bei den Zeitmarken 1 bis 6 durch Zugabe jeweils gleicher Mengen NaCl stufenweise der Betrag des osmotischen Drucks bis zu etwa 20 Mpascal erhöht. Anschließend wurde durch Verdünnung bei den Zeitmarken 7 bis 9 der osmotische Druck jeweils um die Hälfte reduziert. Zu erwarten ist also eine Variation des Zellvolumens als Reaktion auf den Verlauf des osmotischen Drucks und näherungsweise eine Minderung der Zellenkonzentration nur im Verdünnungsabschnitt. Die online-Bildverarbeitung stellt für jedes Bild nach einigen Sekunden Rechenzeit den Größen-Mittelwert und die Anzahl scharf abgebildeter Zellen als Datenpunkt in einer laufenden Meßkurve dar. Die Signalverläufe

in Abbildung 3 entsprechen genau den Erwartungen. Die ISM-Beobachtung osmotischer Effekte wurde vorgeschlagen von V. Camisard, J. P. Brienne und J. P. Cassar, Universit’e de Lille und ist Gegenstand einer Kooperation mit dieser Arbeitsgruppe.

Das Signalrauschen rührt aus zwei Quellen: erstens der prinzipiell statistisch schwankenden Merkmalausprägungen in Bildern mit jeweils relativ geringen Stichproben und zweitens einer zusätzlichen Streuung und Drift des Konzentrationssignals durch strömungsbedingte Fluktuationen. Letztere waren bei diesem Experiment zu erwarten, da im verwendeten Becherglas mit magnetischem Rührer nur eine unvollkommene Durchmischung erreichbar war. Die starke Erhöhung des Rauschens im Größensignal während des Verdünnungsabschnitts wird verursacht durch die Stichprobenverringerung, die mit der Verdünnung einhergeht. Entscheidend ist, daß sich diese Daten in praktisch angemessenen Zeitfenstern von beispielsweise fünf Minuten mitteln lassen und dann eine Messung mit statistischer Unsicherheitskomponente von wenigen Prozenten des Signals ermöglichen. Dies gilt auch für das Konzentrationssignal, das allerdings eine stärkere statistische Fluktuation aufweist als das Größensignal.

Kalibrierung

Für eine gegebene Zellenspezies können die relativen Signale absolut kalibriert werden. Um dies zu zeigen, wurde aus einer Suspension von etwa fünf Gewichtsprozenten Saccharomyces cerevisiae in Wasser eine Verdünnungsreihe über drei Konzentrationsdekaden hergestellt. Die Konzentrationwerte der Verdünnungsreihe wurden mit Hilfe einer Thoma – Zählkammer zu etwa 5 % Unsicherheit absolut kalibriert. Abbildung 4 zeigt die ISM – Zählsignale, logarithmisch aufgetragen über den ebenfalls logarithmisch skalierten Konzentrationen der Verdünnungsreihe. Ein nahezu linearer Verlauf der Kennline in den ersten beiden Dekaden und eine zunehmende Sättigung des Zählsignals in der dritten Dekade werden deutlich. Maßgeblich für die Qualität dieser Punkte zu Erstellung einer Kennlinie ist ihre Reproduzierbarkeit bei Wiederholung der Signalgebung an derselben Verdünnungsreihe – jeweils nach Neujustierung des Instruments. Die Reproduzierbarkeit der ISM – Signale lag bei ersten Tests mit einer Meßzeit von jeweils fünf Minuten pro Datenpunkt bei etwa 6 %.

Fermentationen

Das In Situ Mikroskop wurde bei Fermentationen von Hansenula anomala zur online-Darstellung der mittleren Zellengröße und der Zellenkonzentration angewendet. Die Ummantelung des ISM wurde dabei jeweils vor den Fermentationen in den Bioreaktor eingebaut und im Autoklaven mitsterilisiert. Abbildung 2 b zeigt als Beispiel eines der aus dem Bioreaktor übertragenen Bilder. Die Bildqualität war im Verlauf der Fermentationsdauer von ca 12 Stunden gleichbleibend. Die Publikation dieser Ergebnisse im Rahmen der bereits oben genannten Kooperation ist in Vorbereitung.

Schlußfolgerung

Ein innovativer Prototyp eines In Situ Mikroskops für eine inline-Videomikroskopie in gerührten Zellkulturen und anderen bewegten Partikelsuspensionen wurde gebaut und getestet. Die übertragenen Bilddaten erlauben die direkte Inspektion mikroskopischer Strukturen in gerührten Medien ohne Probennahme. Mit Hilfe automatischer online-Bildverarbeitung wurden kalibrierfähige Signale der Zellengröße und der Zellenkonzentration aus den Bilddaten extrahiert.

Für die Diagnose und Meßtechnik bei laufenden Fermentationsprozessen erschließt das In Situ Mikroskop erstmals mit einer relativ einfachen Instrumentierung das Potential mikroskopischer in-line-Bilddaten. Damit sind einer praxisgerechten Partikelbestimmung für die Bioprozessführung neue Möglichkeiten an die Hand gegeben.

Literatur

[1] SUHR, H., G. WEHNERT, K. SCHNEIDER, C. BITTNER, T. SCHOLZ, P. GEISSLER, B. JÄHNE, T. SCHEPER: In Situ Microscopy for On-Line Characterization of Cell-Populations in Bioreactors, Including Cell-Concentration Measurements by Depth from Focus. Biotechnol. Bioeng. 47, 106–117 (1995)
[2] THOMAS, C. R., G. C. PAUL: Applications of image analysis in cell technology. Current Opinion in Biotechnology 7 No1, 34–45 (1996)
[3] BITTNER, C., G. WEHNERT, T. SCHEPER: In Situ Microscopy – a new approach for on-line determination of biomass. Angenommen zur Publikation in Biotechnol. Bioeng. (1998)

Die Autoren

Prof. Dr. Hajo Suhr
Dipl. Ing. Jochen Hammann
Dipl. Ing. Jürgen Volz